一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)在400～750nm或800nm之間，可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過(guò)氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L(zhǎng)0時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)移至492nm，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H：O：和TMB過(guò)量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根。降低pH，即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng)，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。
除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長(zhǎng)比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長(zhǎng)的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測(cè)定，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測(cè)功能，此時(shí)需要一個(gè)340nm波長(zhǎng)濾光片。此時(shí)，酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能。有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630nm進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀最后打印出來(lái)的吸光度則為二者之差。630nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的，來(lái)自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測(cè)定中，最好使用雙波長(zhǎng)，且不必設(shè)空白孔。
